乙酰谷酰胺注射液中有关物质的研究

　　摘要目的：建立HPLC法测定乙酰谷酰胺注射液中的有关物质。方法：HPLC检测采用SepaxHPC18柱、以0。1的高氯酸水溶液甲醇（991）为流动相、检测波长为210nm、柱温25。结果：6个有关物质能较好地分离，专属性、线性、定量限、检测限、校正因子、系统精密度、溶液稳定性、重复性均符合2010年版中国药典要求，结论：该方法可将乙酰谷酰胺注射液中的乙酰谷酰胺与6个有关物质完全分离。
　　关键词乙酰谷酰胺注射液HPLC有关物质
　　中图分类号：R977。9；R927。11文献标识码：A文章编号：10061533（2016）09007105
　　Studyontherelevantsubstanceinaceglutamideinjection
　　WANGYan1，QIANWeigang1，LIChangwei1，XUJinghua1，SUNDongyan1，ZHOUHuana2，WANGXuemin2
　　（1。ShanghaiZhaohuiPharmaceuticalCo。LTD。，Shanghai201908，C
　　2。NanjingZehengPharmaceuticalTechnologyDevelopmentCo。LTD。，Nanjing210046，China）
　　ABSTRACTObjective：ToestablishanHPLCmethodfordeterminationofrelevantsubstancesinaceglutamideinjection。Methods：HPLCwasperformedonaSepaxHPC18columnwithamobilephaseof0。1perchloricacidandmethanol（99：1）atdetectionwavelengthof210nmandcolumntemperatureof25。Results：Sixrelevantsubstanceswerewellseparated。Thespecificity，linearity，limitofquantitationanddetection，correctionfactor，systemprecision，solutionstabilityandrepeatabilitywereconformedtotherequirementsof2010versionofChinesePharmacopoeia。Conclusion：Aceglutamidecanbecompletelyseparatedwith6relevantsubstancesinaceglutamideinjectionbythismethod。
　　KEYWORDSHPLC；relevantsubstance
　　乙酰谷酰胺为脑功能改善药，具有改善神经细胞代谢、维持神经应激机能及降低血氨的作用〔1〕。临床上主要用于脑外伤性昏迷、神经外科手术等引起的昏迷、瘫痪及智力减退、记忆力障碍等适应证的治疗〔23〕。乙酰谷酰胺注射液收载于中国药典2010版，采用自身对照色谱法检测有关物质〔4〕，该方法仅对最大单杂质及总杂质进行限度检查；《日本药典》16版XVIOfficialMonographs中乙酰谷酰胺铝有关物质检测采用的是杂质外标及峰面积归一化法，该方法对杂质2acetamidoglutarimide及总杂质进行检测〔5〕，但未对其它已知杂质进行定性研究。本文参考中国药典2010版二部乙酰谷酰胺注射液有关物质检查方法和《日本药典》16版XVIOfficialMonographs乙酰谷酰胺铝有关物质检查方法，建立了乙酰谷酰胺注射液有关物质检测方法，通过对乙酰谷酰胺原料合成工艺及乙酰谷酰胺注射液长期留样有关物质进行分析，经与有关物质对照品比较，共定性研究了6个有关物质，为乙酰谷酰胺的生产及质量控制提供了重要的依据。
　　1材料与方法
　　1。1材料
　　高效液相色谱仪（日本岛津公司），含LC20AT泵及SDP20AT紫外检测器及HT230A型柱温箱（日本岛津公司）。色谱柱为SepaxHPC18（美国赛分科技有限公司，4。6mm250mm，5m）。乙酰谷酰胺对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100859200501）；乙酰谷酰胺注射液（111002，111003，111004，上海朝晖药业有限公司，规格：5ml，0。25g）；有关物质A（谷氨酸，中国食品药品检定研究院，批号：100023198601）；有关物质B（L谷氨酰胺，Dr。EhrenstorferGmbh惠赠，批号：10408）；有关物质C（N乙酰D谷氨酰胺，自制，批号：20130110）；有关物质D（焦谷氨酸，CouncilofEuropeEDQM，批号：004P51）；有关物质E（N（2，6二氧代3哌啶基）乙酰胺，自制，批号：20130120）；有关物质F（N乙酰L谷氨酸，自制，批号：20120917）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。
　　1。2有关物质检测方法
　　参考中国药典2010版二部乙酰谷酰胺注射液有关物质检查方法和JPXVIOfficialMonographs乙酰谷酰胺铝有关物质检查方法，建立了HPLC方法测定乙酰谷酰胺注射液的有关物质。取本品，加流动相溶解并稀释制成每毫升中约含1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释制成10gml的溶液，作为对照溶液；同法配置缺乙酰谷酰胺的空白辅料溶液；另精密称取乙酰谷酰胺与有关物质A、B、C、D、E、F对照品适量，加流动相制成0。2mgml1的溶液，作为对照品储备液；分别取乙酰谷酰胺及有关物质A、B、C、D、E和F对照品储备液适量，加流动相溶解并稀释成每1ml中含有关物质A、B各10g，乙酰谷酰胺、有关物质C、D和F各5g，有关物质E0。5g的溶液，作为系统适用性溶液，按相同的方法分别配制相同浓度的单个对照品溶液作有关物质定位溶液。用十八烷基硅烷键合硅胶柱（4。6mm250mm，5m）；以0。1的高氯酸水溶液甲醇（991）为流动相；检测波长为210柱温25，进样量为20l。2结果
　　2。1属性试验
　　2。1。1空白辅料干扰试验
　　精密量取空白辅料、供试溶液及对照溶液各20l进样，记录色谱图，结果显示空白辅料在与对照品保留时间相同的位置上无色谱峰出现，说明空白辅料溶液对主峰无干扰。
　　2。1。2系统适用性试验
　　取系统适用性溶液20l注入液相色谱仪，记录色谱图，同时将各个对照品定位溶液分别取样注入液相色谱仪，定位，结果显示在该色谱条件下，能较好的对乙酰谷酰胺及其有关物质A、B、C、D、E和F进行检查，专属性较好（图1）。
　　2。1。3破坏性试验
　　1）酸破坏产物制备加1molL盐酸溶液2。5ml，室温放置24h，加1molL氢氧化钠溶液2。5ml中和〔6〕。
　　2）碱破坏产物制备加1molL氢氧化钠溶液2。5ml，室温放置3。5h，加1molL盐酸溶液2。5ml中和。
　　3）高温破坏产物制备加流动相5ml，置恒温烘箱中，在120条件下放置约48h，放冷。
　　4）氧化破坏产物制备加10H2O25ml，室温放置约48h。
　　5）光照破坏产物制备加流动相5ml，4500Lux条件下放置约48h。
　　结果表明，乙酰谷酰胺溶液在高温下破坏较明显、在光照条件下相对较稳定（表1）。
　　在各强制降解试验条件下，物料平衡率较好，说明该方法检出能力较好；主峰峰纯度检查中，主峰中均未检测到不纯物，说明该方法能较好地分离主峰与各降解产物（表2）。
　　2。2线性关系
　　量取乙酰谷酰胺储备液适量，用流动相稀释制成每毫升中含乙酰谷酰胺为0。82、2。04、4。09、6。13、10。22、20。44g的系列溶液。精密量取上述溶液各20l，注入液相色谱仪。同法对有关物质A、B、C、D、E和F对照品进行线性关系研究，以浓度C（gml）为横坐标，峰面积A（mAumin）为纵坐标，进行线性回归，结果显示不同对照品在不同浓度范围内显示出与峰面积较好的线性关系（表3）。
　　2。3校正因子
　　以上述2。2线性关系项下线性曲线，计算有关物质A、B、C、D、E和F相对于乙酰谷酰胺的校正因子，结果显示：有关物质C和D校正因子在0。91。1范围内，可采用主成分自身对照法进行检查；有关物质A、B和F校正因子超出0。91。1，但在0。25。0范围内，可采用加校正因子的主成分自身对照法进行检查；有关物质E校正因子为0。08，可采用外标法来进行检查（表3）。
　　2。4回收率
　　考虑到杂质E检查为外标法，考察了杂质E在乙酰谷酰胺注射液有关物质检查溶液中的加样回收率。
　　精密量取本品注射液1ml（相当于乙酰谷酰胺50mg），分别置于9个50ml量瓶中，分别精密加入12。60gml的有关物质E对照品溶液4ml、2ml、1ml各3份，用流动相稀释至刻度，作为加样供试品溶液。精密量取20l进行色谱检测。按外标法以峰面积计算杂质E的测得量（扣除乙酰谷酰胺注射液中杂质E量），并计算杂质E回收率（表4）。
　　由表4可知，按外标法以峰面积测定杂质E的量，其加样回收率在86。898。2之间，各含量RSD为4。25（n9），表明外标法测定杂质E的准确度较高。
　　2。5定量限与检测限
　　以10倍噪音（SN10）计算最低定量限，以3倍噪音（SN3）计算最低检测限（表5）。
　　2。6精密度试验
　　精密量取系统适应性溶液20l注入色谱仪，连续进样6次，考察系统精密度。结果显示它们的峰面积无明显变化，RSD均小于10，说明该方法系统精密度较高（表6）。
　　2。7稳定性试验
　　取供试品溶液与对照品溶液，分别于不同时间（0、1、2、4、6、8h）取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示几个有关物质和总有关物质RSD都小于2，表明供试品溶液在室温放置8h内稳定（表7）。
　　2。8重复性试验
　　配制供试品溶液、对照品溶液6份，各精密量取20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，考察方法的重复性。结果显示：测定6份供试品溶液中各已知有关物质及总有关物质的量，RSD均在10以内，说明该检查方法重复性较好（表8）。
　　2。9样品中有关物质的测定
　　按照上述建立的乙酰谷酰胺注射液中有关物质检测方法，对乙酰谷酰胺原料、乙酰谷酰胺注射液长期留样进行测定〔7〕：结果显示：生产的三批注射液与原料相比，有关物质A、C、D、E、F含量有一定增加；有关物质A和E在多批次长期放置不同时间无明显增加趋势，有关物质C、有关物质和F及总有关物质逐渐增加（表9）。
　　3讨论
　　3。1检验方法
　　乙酰谷酰胺主峰及其各个有关物质无最大吸收，为末端吸收，在210nm波长处均有较好的吸收，同时参考中国药典2010年版乙酰谷酰胺注射液及JP乙酰谷酰胺铝中乙酰谷酰胺的含量测定方法，选择波长210nm为检测波长。
　　3。2有关物质分析
　　文献〔8〕报道，乙酰谷酰胺在酸、碱、加热等强制降解试验条件下会产生降解杂质，其主要降解途径有：乙酰谷酰胺经水解产生N乙酰D谷氨酰胺（有关物质C）及N乙酰L谷氨酸（有关物质F），脱水产生N（2，6二氧代3哌啶基）乙酰胺（有关物质E），脱乙酰基产生谷氨酰胺（有关物质B）；乙酰谷氨酸脱乙酰基或谷氨酰胺水解生成谷氨酸（有关物质A），谷氨酸进一步脱水形成焦谷氨酸（有关物质D），它们的编号则是按照液相色谱图中各自保留时间的先后顺序而定。故可选用已知有关物质对乙酰谷酰胺注射液的有关物质进行分析测试〔3〕。
　　供试品在酸破坏试验中会降解产生有关物质，根据乙酰谷酰胺分子和文献报道判断可能发生闭合或聚合，而在有关物质检查过程中之所以采用酸性流动相溶解样品，因为从上述试验可知，供试品溶液在8h内稳定，不会造成分析过程中有关物质增多。
　　3。3方法验证
　　对有关物质检查方法进行方法学验证表明，该方法能较好地对本品的有关物质进行检查。与原质量标准及2015年中国药典〔9〕相比，该方法能使乙酰谷酰胺注射液中的乙酰谷酰胺与多达6个杂质互相分离，并可对它们进行定量检测，与2015年版中国药典关于药品质量标准分析方法验证指导原则相一致，且数据准确、可靠。
　　参考文献
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