氮还原催化新发现！NatureCatalysis固氮酶新机制

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　　第一作者：ChiChungLee
　　通讯作者：YilinHu，MarkusW。Ribbe
　　通讯单位：加州大学欧文分校
　　论文DOI：https：doi。org10。1038s41929022007827
　　全文速览
　　钼固氮酶在常规环境下催化还原N2到NH3发生在M团簇处。该团簇是一种复杂的辅助因子，包含两个由间隙碳化物连接的金属硫部分立方烷和三个带硫。最近的一项晶体学研究表明，N2的结合是通过M簇的带硫在转换时的位移来实现的。然而，在催化过程中N2结合和带硫移动的直接证据仍然没有发现。该研究工作表明N2通过电子和硫的消耗被捕获在M簇上，并且N2捕获状态在生成NH3方面具有催化能力。此外，本文证明只有当亚硫酸盐与还原剂一起提供时才会发生产物释放，亚硫酸盐作为硫化物插入到带硫置换的位置，并且在催化过程中存在带硫的动态进出。总之，这些结果确立了辅因子带硫的移动作为固氮酶反应的关键。
　　背景介绍
　　固氮酶是一种复杂的金属酶，与农学、环境和能源等领域有着密切的关系。作为全球氮循环中的一个关键步骤，固氮酶在催化大气N2转化为生物可利用NH3方面的作用广为人知，固氮酶还可以在模拟环境反应中将CO和CO2还原为碳氢化合物（例如，CH4、C2H6、C3H8），用于生产碳燃料。除了N2和CO，固氮酶还能够还原多种替代底物，包括C2H2，CN，N3和H，进一步说明了这种重要金属酶的催化多功能性。传统钼（Mo）固氮酶的催化是通过一个双组分系统完成的，该系统利用还原酶组分将电子传递给催化组分以进行底物还原。还原酶成分，称为铁（Fe）蛋白，是一种同源二聚体，包含一个亚基桥接〔Fe4S4〕簇和每个亚基内的ATP结合位点；被称为催化成分的钼铁（MoFe）蛋白是一种22异四聚体，其在每个亚基界面含有一个P簇（〔Fe8S7〕），以及在每个亚基内含有一个M簇（或FeM〔（Rhomocitrate）MoFe7S9C）。在底物转换过程中，钼固氮酶的两种成分蛋白相互形成功能复合物，使ATP依赖的电子从Fe蛋白的〔Fe4S4〕簇通过P簇转移到M簇。MoFe蛋白，一旦积累了足够数量的电子，就会发生底物还原。
　　固氮酶的功能重要性和与生俱来的复杂性，激发了几代研究人员对这种酶促N2还原机制进行研究；LoweThorneley模型是迄今为止最知名的动力学描述，用于解释质子的蛋白内传递和电子到M簇以进行底物结合、活化和还原。另一方面，由于这些结合物种的瞬态特性，研究人员已证明固氮酶的底物或中间结合状态表征极具挑战性。在这方面的研究中，冷冻淬火光谱技术与钼固氮酶活性位点基因修饰相结合，已被用于表征这种酶的某些状态，这些状态可能与催化相关。然而，获得Mo固氮酶配体结合状态分子描述的一个非常重要步骤来自于MoFe蛋白的CO结合形式的高分辨率晶体结构，它揭示了2CO配体桥接在M簇的Fe2和Fe6之间，代替了带状硫（S2B）。这一结果令人兴奋，因为它指出了一种机制，涉及通过取代辅助因子的带硫产生活性Fe物质。更有趣的是，在S2B位点进行的后续晶体脉冲追踪研究表明辅助因子的整个带区域可能参与催化。
　　图文解析
　　图1。N2结合的Av1的GCMS和频率选择性NMR分析。a、b，产生的C2H4的GC洗脱曲线（a）和GCMS碎裂模式（b）；条件分别为在D2C2H2下的Av1（灰色）、N2D2C2H2下的Av1（蓝色）和D2C2H2下的Av1（棕色），基于H2O的反应。c，在Av2、MgATP和连二亚硫酸盐存在下，在Ar下转换时，由Av1（实心蓝色）、14N2制备的Av1（实心红色）和15N2（实心棕色）制备的Av1生成NH4的频率选择性1HNMR光谱。
　　图2。各种Av1蛋白种类的EPR和GCMS分析。aj，垂直模式（ae）和平行模式（fj）的EPR光谱，用于测试静息态Av1（a，f），N2结合的Av1（b，g），连二亚硫酸盐重新激活的Av1（TOD）（c，h）、Eu（II）EGTA亚硫酸盐再活化Av1（TOS）（d，i）和Eu（II）EGTA亚硒酸盐再活化Av1（TOSe）（e，j）。ko，对Av1（k）、Av1（l）、Av1（TOD）（m）、Av1（TOS）（n）和Av1（TOSe）（o）酸淬灭后释放的15N2进行GCMS分析。
　　图3。底物转换对亚硫酸盐物种的要求。a，在含有Av2、MgATP和Eu（II）EGTA的体外活性测定中，在不存在（S）或存在各种硫源（S2，SO42和SO32）或亚硒酸盐（SeO32）的情况下，Av1的活性。b，在含有Av2、MgATP和Eu（II）EGTA的体外测定中，Av1的C2H2还原活性与亚硫酸盐（SO32）或亚硒酸盐（SeO32）浓度的滴定关系。c，使用2mMSO32（实心绿色固体）或NFE（空心圆圈）作为硫源，在C2H2还原中，Av1活性与时间的关系。
　　图4。Av1（TOS）的晶体学分析。Av1（TOS）的链AB（P团簇（AB））（a）和链CD（P团簇（CD））（b）界面处的P团簇结构。原子颜色编码：Fe，橙色；S，黄色；O，红色；N，蓝色。cf，链A（M簇（A））（c，e）和链C（M簇（C））（d，f）中，M团簇的结构。c，d，侧视图；e，f，沿M团簇（A）（c，e）和M团簇（C）（d，f）的Fe1CMo轴的视图。
　　图5。带状硫与催化相关的移动。a，各种Av1蛋白或蛋白链中单个硫或硫基团的相对电子密度。b，c，GCMS分析Av1（TOS）（b）及其分离的M簇（c）中酸不稳定、簇结合的34S2离子的释放。d，ICPOES测定从不同样品提取的M簇中的SeMo比。
　　图6。Av1（TOSe）的XASEXAFS分析。ag，对Av1（TOS）在过量SeO32中转换10min（指定为Av1（TOSe），黑色），Av1（TOSe）在过量SO32中转换5min（指定为Av1（TOSe）5min，蓝色）和Av1（TOSe）在过量SO32转换60min（指定Av1（TOSe）60min，红色），获得的Fe（ad）和SeKedgeXAS分析（eg）。
　　图7。SO32的配位和还原。ac，由SO32或NH3配位的M簇的DFT优化模型。d，两种SO32配位情况下的反应能，假设耦合的eH转移发生在初始配位步骤之后。e，在两种SO32配位情况下，硫掺入的累积反应能。
　　总结与展望
　　基于上述结果，本文结合使用生化、分析、光谱和结构方法来证明N2在电子和硫耗尽条件下被捕获在M簇上，并且这种N2捕获状态与催化相关，能够产生NH3。此外，研究表明产物释放仅在亚硫酸盐和还原剂存在的情况下发生，亚硫酸盐作为硫化物插入到带硫置换的位置，并且在催化过程中存在带硫的动态流动。这些证据共同指出带硫的移动是固氮酶机制的一个新的关键因素。