磷酸锆在电化学葡萄糖传感器中的应用

　　生物传感器作为一种新型的检测技术具有体积小，成本低，准确、灵敏、易操作，又不会或很少损伤样品或造成污染，可现场检测等优点，因此国内外对生物传感器展开了广泛深入的研究，且纳米材料在生物传感器中的应用也已经进入新的研究阶段。这是因为纳米材料的量子尺寸效应和表面效应可以有效地提高生物传感器的响应性能。
　　作为典型二维纳米材料的层状材料被认为是增强电化学生物传感器响应信号最有前景的材料之一。利用层状材料来修饰电极引起了许多电化学工作者的关注。这是因为层状材料具有许多优异性质：材料廉价易得，独特的层间离子交换性能，层板可调控性，很好的生物相容性和化学稳定性等。磷酸锆类层状化合物就是一种最具有代表性的层状材料。用无机材料ZrP等作为载体进行细胞色素和辣根过氧化酶的固定化，获得了良好固载效果。这就充分地证明了磷酸锆层状材料作为酶同定化载体的可行性。
　　将ZrP层状材料进行剥离，剥离的ZrP比表面积大、表面活性中心多以其作为插层主体，将葡萄糖氧化酶（GOx）引入到ZrP层间，制成了电化学葡萄糖传感器并将其应用于葡萄糖的检测中。由于ZrP层状材料具有良好的导电性，从而提高了生物传感器的灵敏度、稳定性及抗干扰能力。
　　实验部分
　　1、仪器和试剂
　　ZrP（from绵竹耀隆化工）、BD葡萄糖、葡萄糖氧化酶（GOx，196000unitg）、四丁基氢氧化铵（TBAOH）、壳聚糖和二茂铁甲酸（FcCOOH）。配制三种不同的磷酸盐缓冲溶液（二茂铁甲酸）：
　　（1）10mmolLPBS，pH7。0；
　　（2）10mmolLPBS，pH7。0，1mmollLCa2）；
　　（3）10mm01LPBS，pH7。0，1mmolL
　　实验中所用的其它试剂均为分析纯。所用水均为二次蒸馏水。所有实验均在室温下进行。
　　循环伏安法、差示脉冲伏安法和计时电流法均在CHI760B型电化学工作站上室温下进行。计时电流法时，支持电解质的体积为10mL。电化学实验采用三电极体系，修饰的玻碳（GCE，直径4mm）电极为工作电极，AgAgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。利用DOmax2500Xray粉末衍射仪对样品的结构进行分析。利用JSM一5600LV显微镜进行扫描电子显微镜（SEM）分析。
　　2、ZrP的剥离和葡萄糖氧化酶的固定
　　首先配置2ZrP的悬浊液。即将0。2gZrP溶解在10mL的二次蒸馏水中，然后加入适量的TBAOH。这样得到的悬浊液在室温下搅拌12h使ZrP剥离，再置于超声仪中超声40min，从而加快ZrP的剥离并使其能充分分散，将制得的2ZrP的悬浊液和2。3mgmLCOx溶液按照3：1的体积比进行混合在室温下放置1h使其达到平衡状态。反应完毕后反应液在10000rmin的转速下离心10min。使游离的葡萄糖氧化酶与已经同定的葡萄糖氧化酶分离。再用二次蒸馏水进行清洗。最后将所制备的GOxZrP冻干。干燥之后可以发现。没有和GOx发生反应前，ZrP的粉末是白色的。当进行完以上反应过程后。得到的GOxZrP粉末变成了黄色，证明了GOxZrP的成功合成。
　　3、葡萄糖传感器的制备
　　在使用玻碳电极前，分别用1和0。05um的铝粉打磨电极，直到获得光滑的玻碳电极镜面为止。然后冲洗干净，再分别用二次蒸馏水、乙醇溶液和二次蒸馏水超声1min。将由上面过程制得的干燥的GOxZrP粉末取1mg溶解分散到0。5mL二次蒸馏水中，然后取6uL的混合液滴在经过预处理的玻碳电极的表面，干燥后，再滴6uL0。3的壳聚糖溶液再置于4冰箱中过夜自然干燥即可得到所需的生物传感器界面。在不使用时，将修饰有GOxZrP的电极置于4冰箱中干燥保存。
　　结果与讨论
　　1、ZrP和GoxZrP的表征
　　XRD作为研究晶体结构的一种重要手段。被广泛用来表征无机纳米材料。图1是GOxZrP的XRD衍射图。GOxZrP层间距的测量按Bragg定律进行计算。根据Bragg定律（从00l反射（Z1，2，etc））由此可以算出d11。6nm，即葡萄糖氧化酶的介入，使ZrP的层间距增大，同时可以表明葡萄糖氧化酶已经进入到ZrP的夹层当中。
　　图2是制备的GOxZrP层状材料的扫描电镜图。图2（a）为制备GOxZrP的低倍扫描电镜图。从图中可以看到制备的GOxZrP的大致形态。其薄膜表面致密并且比较均匀，这表明了GOxZrP膜的形成及其形成的层层组装的方式比较一致。图2（b）为GOrZrP的高倍扫描电镜图，从图中可以看到，层片状的GOxZrP，较均匀的排列，粒径较小，分层形成小的聚合体。
　　2、GOxZrP修饰电极的电化学行为
　　图3中曲线a是在0。1molL磷酸盐缓冲溶液中（pH7。0）GOxZrP修饰电极的循环伏安曲线图。从图中可以看出GOxZrP修饰电极的循环伏安曲线没有明显的氧化还原峰，当往磷酸盐缓冲液中加入1mmolL二茂铁甲酸后出现一对很明显的氧化还原峰（曲线b），但当继续加入1mmolL葡萄糖时。其循环伏安曲线发生了明显的变化（曲线C），氧化峰电流明显增大，而还原峰电流减小。这说明葡萄糖在GOx的催化作用下，发生氧化反应使氧化还原曲线发生显著的变化。在该过程中。二茂铁甲酸只是媒介体，起着传导电子的作用其氧化还原反应的反应机理：
　　在没有加入葡萄糖（曲线b）的情况下，加入二茂铁甲酸，只会发生（3）反应，（1）和（2）不发生，所以得到的是可逆的循环伏安曲线；但当在GOx存在同时二茂铁甲酸也存在的条件下。加入葡萄糖（图3曲线c），（1）和（2）反应与（3）同时发生，由于（1）和（2）反应中发生的是得电子的过程，这与（3）中FcCOOH（ox）FcCOOH（red）的半反应的得电子过程相竞争，使得还原峰电流减小；同时在整个反应中生成的FcCOOHred）增多，从而使得（3）的FcCOOH（red）FcCOOH（ox）的半反应失电子增多，氧化峰电流增大。因此便得到了图3中的曲线C的氧化还原曲线图。
　　在固定葡萄糖的浓度为2mmolL的情况下，考察了不同浓度的二茂铁甲酸对GOxZrP膜修饰电极电化学行为的影响。图4是GOxZrP膜修饰的玻碳电极在10mmolL磷酸盐缓冲溶液（pH7。0）中加入不同浓度的二茂铁甲（浓度范围0。150umolL）的差示脉冲伏安响应曲线。从图4可以看出。随着二茂铁甲酸浓度的增大，其电流响应也随之增大，且峰位置保持不变。由此可以得出二茂铁甲酸的浓度对GOxZrP膜修饰电极对葡萄糖的响应值有很大的影响。二茂铁甲酸的浓度越高。其响应值也就越大。由此可见，二茂铁甲酸的浓度影响了GOxZrP膜修饰电极的信号强度，同时也直接影响了传感器的检测下限另外二茂铁甲酸的浓度与电流响应值之间存在正比例关系。综合以上结论可以得出高浓度的二茂铁甲酸对该实验是有利的。但由于二茂铁甲酸在中性条件下溶解度不高整个实验过程采用二茂铁甲酸的浓度为1mmolL。
　　3、生物传感器的响应特性及葡萄糖的检测
　　图5是GOZrP膜修饰的玻碳电极对葡萄糖催化的循环伏安曲线图。从图中可以看到，当加入不同浓度的葡萄糖时。其氧化峰电流随葡萄糖浓度的增大而增大。而还原峰电流则随葡萄糖浓度的增加而不断减小氧化峰。并且氧化峰和还原峰的峰位置都不变，这是典型的电催化峰形特性。这表明了GOZrP膜修饰的玻碳电极在二茂铁甲酸存在的条件下对葡萄糖有很高的电催化活性。
　　图6A是GOZrP膜修饰的电极对葡萄糖响应的计时电流图，图6B为葡萄糖传感器的标准曲线。从图中可以看到该传感器对葡萄糖有灵敏快速的响应。在0。0l20mmolL范同传感器呈良好的线性关系，相关系数为0。996，根据SN3的原则可以得出检测下限为0。01mmolL。由于传感器的线性范围覆盖了4个数量级这表明了有大量的酶分子固定到电极表面。另外传感器对葡萄糖的灵敏度为4。74uA（mmolL）。
　　结论
　　将ZrP进行剥离，通过ZrP与葡萄糖氧化酶的自组装，在ZrP层间成功地插入了葡萄糖氧化酶，再将该复合物同定到玻碳电极的表面，这样制得的电化学葡萄糖传感器在用二茂铁甲酸作电子媒介体时对葡萄糖响应迅速，并有较宽的线性范围和较高的灵敏度。